컴퓨터 스크리닝 방법을 최적화하기 위해 유전자 알고리즘을 통합하여 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 BamA 단백질에 대한 항균 압타머 선택

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 7582(2023) 이 기사 인용

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항생제 내성은 한때 항생제로 쉽게 치료할 수 있었던 감염으로 인해 심각한 질병을 앓고 있거나 사망하는 사람들의 수가 증가하고 있는 세계 보건에 대한 가장 큰 위협 중 하나입니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 항생제 내성이 급격히 발달한 주요 병원체로, WHO는 이 병원체를 중요 목록으로 분류했습니다. DNA 압타머는 새로운 항균제의 잠재적 후보로 작용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 기존 압타머가 P. aeruginosa의 성장에 영향을 미칠 수 있음을 입증했습니다. 그람 음성 박테리아에서 잘 보존되고 필수적인 외막 단백질인 BamA에 결합할 수 있는 압타머에 대한 컴퓨터 스크린이 수행되었습니다. BamA 단백질을 사용한 약 100개의 기능성 DNA 압타머의 분자 도킹은 로컬 및 글로벌 도킹 접근 방식을 통해 수행되었습니다. 또한 결합 친화도를 기준으로 압타머의 순위를 매기기 위해 유전자 알고리즘 분석을 수행했습니다. BamA 단백질에 잘 결합하는 압타머의 최고 히트작을 합성하여 시험관 내 항균 활성을 조사했습니다. 모든 압타머 중에서 항종양제인 Daunomycin과 결합하는 것으로 알려진 Apt31은 가장 높은 HADDOCK 점수를 나타냈고 P. aeruginosa 성장이 유의하게(p < 0.05) 감소했습니다. Apt31은 또한 막 파괴를 유발하여 DNA 누출을 초래했습니다. 따라서 컴퓨터 스크리닝을 통해 원하는 활성 부위에 높은 친화력으로 결합하는 압타머를 식별할 수 있습니다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 많은 병원감염을 일으키는 그람음성 기회감염균으로 감염된 환자의 낭성섬유증 폐에 존재하는 주요 병원체이다. 게다가 이는 인공호흡기 관련 폐렴, 요로 카테터 관련 감염, 수술/이식 감염 등 기타 병원 내 감염과도 관련이 있습니다1. 최근에는 녹농균(P. aeruginosa)이 코로나19 환자에서 동시 감염을 일으키는 두 번째로 가장 많이 발견되는 병원체인 것으로 밝혀졌습니다2,3,4. 세계보건기구(WHO)는 이 치명적인 유기체를 ESKAPE 병원체로 분류했으며, 다제내성(MDR) 균주의 출현으로 인해 우선순위 1: 중요 목록에도 분류되었습니다. P. aeruginosa로 인한 감염은 특정 계통이 현재 사용 가능한 거의 모든 항생제, 심지어 최후의 수단 치료에도 내성을 나타내어 전 세계적으로 이환율과 사망률이 증가하는 곳에서 치료가 점점 더 어려워지고 거의 불가능해지고 있습니다5. 따라서 이러한 글로벌 보건 위기를 극복하기 위해서는 새로운 항균제의 발굴이 시급히 요구되고 있다.

항생제 생산은 항생제가 시장에 출시되기까지 거의 10년이 걸릴 정도로 비용이 많이 들고 힘들지만, 박테리아가 항생제에 대한 내성을 키우는 데는 빠르면 11일이 걸릴 수 있습니다6. 따라서 항생제 내성(AMR)으로 인한 전 세계 빈곤을 예방하기 위해서는 대안적인 접근 방식을 고려해야 합니다. 약물 재배치(drug repositioning) 또는 약물 재구성(drug reprofiling)이라고도 알려진 약물 용도 변경(drug repurposing)은 기존 약물의 새로운 치료 적응증을 발견하면 약물 개발 기간과 비용을 줄일 수 있기 때문에 최근 제약업계에서 큰 주목을 받고 있습니다. 용도 변경 약물의 안전성과 독성도 잘 연구되었으므로 새로운 치료 용도로 사용하기에 안전한 것으로 간주될 수 있습니다. 따라서 압타머의 용도를 변경하면 새로운 압타머 발견 및 약물 개발에 소요되는 비용과 기간을 줄일 수 있습니다. 앱타머는 미생물학 분야에서 진단 및 치료를 위한 유망한 도구로 부상했습니다. 앱타머는 단백질과 같은 분자 표적과 특이적으로 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 접힌 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(DNA/RNA)입니다. 이러한 결합은 치료 효과를 이끌어낼 수 있으며 많은 치료용 압타머가 이미 임상 시험을 진행하고 있습니다. 예를 들어, Macugen은 FDA의 승인을 받은 압타머이며 황반 변성 치료 약물로 시중에 판매되고 있습니다7. 압타머는 비용 효율적이고 가장 중요하게는 낮은 면역원성, 짧은 생산 일정, 높은 안정성 등 항체 및 항생제에 비해 다양한 장점을 가지고 있기 때문에 잠재적인 항균제입니다8. 압타머는 구조적 및 화학적 변형에도 유연하여 결국 임상 적용 범위를 확장합니다8. 또한, 그람 음성 박테리아의 외막 층의 낮은 투과성이 AMR 발달의 주요 원인 중 하나이기 때문에 박테리아에서 앱타머 결합에 적합한 표적을 식별하는 것도 중요합니다9. 따라서 선택된 표적은 P. aeruginosa의 낮은 투과성 외부 막층을 통과할 필요 없이 쉽게 접근할 수 있어야 하며 따라서 외부 막 단백질이 잠재적인 표적이 될 수 있습니다.

90% of the residues fell under the most favoured region. Besides, the Ramachandran plot (Supplementary Fig. 2) also predicted that the model consisted mostly of β-sheets with small segments of α-helix which corresponded to the secondary structures BamA and other outer membrane proteins. The final Pseudomonas BamA structure with a lateral gate is shown in Fig. 1C. Darobactin was docked with Pseudomonas BamA to determine its binding site. The experimental PDB structure of E. coli (7P1C) and modelled Pseudomonas BamA bound to Darobactin were shown for comparison in Fig. 1D. The similar binding site in both experimental and modelled structures further validates the Pseudomonas BamA model./p> 0.05) as Apt31, as these aptamer candidates exhibited higher HADDOCK scores and they were binding distant from the lateral gate in global docking. The measured DNA concentration for the DNA leakage assay was solely dependent on the DNA released by the bacteria cells as purification of the supernatant completely removed the aptamers (Supplementary Fig. 3). In addition to growth inhibition, the concentration of DNA released was also higher for the Apt31 treated group compared to Apt33, HTO008 and the control group (Fig. 4D). This suggests that the Apt31 treatment resulted in compromised membrane integrity in P. aeruginosa cells./p> 0.05) effect on P. aeruginosa growth and survival as well as in DNA leakage compared to PBS control. Although Apt33 ranked first in the GA analysis, it did not show any significant (p > 0.05) effect on bacterial growth. This may be due to its binding site which was further away from the lateral gate region in the global docking analysis. The GA ranking was based on HADDOCK 2.4 output which uses a local docking approach where the binding site in BamA needs to be specified. Under natural conditions, the Apt33 might bind further away from the lateral gate as implied by the global docking which may not inhibit BamA activity. Moreover, the Gibbs Free Energy for Apt33 is also high which indicates that the folding is unfavourable and the structure has low stability. This may also account for the insignificant effect of Apt33 on P. aeruginosa growth. In future, both local and global docking approaches should be analysed concurrently to obtain reliable and specific drug binding. Besides, more advanced machine learning techniques coupled with global and local docking analysis can reveal the best binding aptamers to the lateral gate region in BamA. The antibacterial effect of Apt31 can be further enhanced by making some chemical modifications to the aptamer to increase its binding affinity and stability. The binding of Apt31 to BamA in P. aeruginosa with high affinity can be challenging due to the repulsion between the negatively charged aptamer and the negatively charged outer membrane39. In addition, nucleases produced by bacteria can also degrade the aptamer, thereby decreasing its antibacterial activity. Hence, modifying the aptamers such as replacing the phosphodiester linkage of DNA with methylphosphonate will reduce the overall negative charge of the aptamers and facilitate the binding of aptamers to the outer membrane protein40. Modification to the sugar ring of nucleoside such as 2′-O-methyl-substitution in the aptamer can also resist nuclease degradation and increase the thermostability40./p>